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人血清中总甲状腺激素T3质谱参考方法解读
发布日期:2020-09-09   来源:本站   浏览数:827

        本期给大家介绍的为人血清中总甲状腺激素T3质谱检测参考方法,希望能给计划开展该项目的老师一些帮助和参考。 本参考方法由美国马里兰州盖瑟斯堡国家标准和技术研究所分析化学部门发表。


        简介


        甲状腺激素T3是评价甲状腺功能的重要标志物,是甲状腺激素对各种靶器官作用的主要激素。血清TT3浓度反映甲状腺对周边组织的功能优于反映甲状腺分泌状态。TT3是查明早期甲亢、监控复发性甲亢的重要指标。TT3测定也可用于T3型甲亢的查明和假性甲状腺毒症的诊断。


        文章中提到常规检测T3的方法是采用免疫法检测,该方法虽然有不错的灵敏度,但是特异性较差。本法采用同位素稀释液质联用法,能同时满足高的灵敏度和特异性。


        方法概述


        参考物质及样本


        实验当中用到的冷冻血清样本为美国病理学会(CAP)提供;标准参考样本为来自美国NIST的SRM 1951b(Level 1水平的冷冻人血清);T3参考物质来自Aldrich,其杂质含量由NIST使用LC/MS进行的评估,其水分也由卡尔费休滴定法进行的确定。


        前处理


        前处理方法为样本加入内标和缓冲盐稀释后,采取丙酮冰浴的方法去除蛋白,然后使用具有反向和离子交换混合保留机制的固相萃取(Bond-Elut Certify SPE cartridges, LRC)进行浓缩富集,最后氮吹复溶上液质联用检测。


        液质联用


        液质联用系统为2795LC与Waters Quattro Ultima三重四级杆质谱仪联用模式。色谱柱采用安捷伦Zorbax Eclipse XDB-C18。质谱检测模式为MRM正离子,液相分离模式为梯度分离。


        难点与解决方案


        难点:文章中提到检测T3的难点主要有三个,其一是在血清中的含量低;其二是高于T3浓度100倍的T4容易转化为T3,从而影响T3的检测结果;其三是如何确定T3完全从蛋白质中释放出来所需的时间。


        解决方案①为解决T3含量低的问题,方法主要采取具有反向和离子交换混合保留机制的固相萃取进行浓度富集,以及整个操作过程是在避光条件下进行,包括用到的试剂瓶均需要用铝箔包裹好。


         ②为解决高浓度T4转化为T3的问题,实验过程中向样品中添加了抗坏血酸、二硫苏糖醇以及柠檬酸来尽可能的防止样本中的T4脱碘为T3。方案中是通过监测T4-d5变为T3-d5的转化率,来说明样本中T4到T3的转化率。加入上述三种试剂后,能把T4向T3的转化率控制在3%以内。


        ③为了确定与蛋白结合的T3更完全的释放出来所需时间,以及T3和内标T3-13C平衡所需的时间,实验设计了三个时间点(1h、2h、3h)进行考察。最后发现,在试样加入内标后,需要在室温条件下静置1h才能达到平衡,并确保T3与T3-13C的比值在三个小时内不会发生变化。


        结果


        该参考方法测了三个批次的冷冻血清池,批内重现性的CV在0.8%-1.6%,批间重现性的CV在1.9%-2.6%,线性相关系数在0.995-0.996之间,检出限低至1pg。


表1 样本T3添加回收率 


表2 方法重现性数据


表3 扩展不确定度的评估



        总结


        该参考方法具有良好的准确度和精密度,低干扰和低的T4向T3的转化率,与常规T3检测方法、其他RMP方法具有可比性,符合ISO 19153中定义的参考测量程序。


        注:如有原文需求,可点击阅读原文并留言附邮箱索取


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